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T3 RNA聚合酶是一种高度特异识别T3启动子序列的DNA依赖的5'→3'RNA聚合酶。T3 RNA Polymerase可以催化单链或双链DNA T3启动子下游NTP的掺入，合成与T3启动子下游的模板DNA互补的RNA。

T3 RNA聚合酶可以识别修饰的NTP，例如生物素标记、地高辛标记、荧光素标记的NTP，可以用于各种标记RNA的合成。同时对于T3启动子有高度的特异性。

用于RNA合成，合成的RNA可以用于或用作：杂交探针，基因组DNA序列分析，核糖核酸酶保护测定，反义RNA合成，作为体外翻译的RNA模板，RNA剪接研究的底物，RNA二级结构和RNA-蛋白质相互作用，核酸扩增分析，siRNA、miRNA等小RNA。


由大肠杆菌表达，表达基因为嗜菌体T3 RNA Polymerase基因。


37℃ 60分钟内，催化1nmol AMP掺入到多聚核苷酸中所需的酶量定义为1个活性单位。
活性检测条件：
40mM Tris-HCl(pH8.0)，6mM MgCl₂，10mM DTT，2mM spermidine，0.5mM NTP，0.6MBq/ml[³H]-ATP，20μg/mL plasmid DNA containing the specific T3 RNA Polymerase promoter sequence。


70℃加热10分钟可使T3 RNA Polymerase失活。加入适量EDTA也可以使T3 RNA Polymerase失活。螯合剂、浓度大于150mM的钠、钾或铵盐可以显著抑制T3 RNA Polymerase的活性。


T3的consensus promoter sequence如下：
-15 -10 -5 +1 +5
AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA

组分	规格
T3 RNA Polymerase(20U/μl)	500U
5×Transcription Buffer	0.2mL

保存：-20℃


50mM Tris-HCl(pH8.0)，150mM NaCl，5mM DTT，0.1mg/mL BSA，0.5mM Elugent，50% glycerol。


5×Transcription Buffer：
200mM Tris-HCl(pH7.9 at 25℃)，30mM MgCl₂，50mM DTT，50mM NaCl，10mM spermidine。


不含DNA内切酶和外切酶，不含RNA酶。

• 酶使用时宜存放在冰盒内或冰浴上，使用完毕后宜立即放置于-20℃保存。
  
• 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• RNA合成：
  
  • DNA模板经限制性核酸内切酶酶切线性化。
    
  • 酚/氯仿抽提DNA，用乙醇沉淀后，溶于适量的无菌去离子水中。本步骤也可以使用适当的DNA纯化试剂盒，例如百奥莱博的DNA纯化试剂盒(YT009)，直接进行纯化，从而免去了酚氯仿抽提和乙醇沉淀这些步骤。
    
  • 参考如下表格设置反应体系：
    

    成分	用量
    5×Transcription Buffer	10μL
    NTP Mixture (10mM each)	10μL
    线性DNA模板	1μg
    Ribonuclease Inhibitor	50U
    T3 RNA Polymerase	30U
    经DEPC处理的去离子水	至50μL

    
    
  • 按上表设置好反应体系后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体。
    
  • 37℃孵育1～2个小时。
    
  • 加入2μL 0.5M EDTA (pH8.0)到反应体系中混匀或-20℃冷却终止反应。
    
  • 电泳分析转录产物，或通过其他适当方法鉴定转录的效率。
    注意：
    ① 转录需在无RNA酶条件下进行。
    ② 反应体系需在室温条件下配置，4℃有亚精胺(spermidine)存在时DNA可发生沉淀。
    ③ 按以上反应条件，每1μg模板DNA可合成超过10μg的RNA。
    ④ 如果模板DNA的线形化不太完全，会导致转录出比预期长度更长的RNA，同时使预期长度的转录本比例下降。
    ⑤ 可根据实际情况按照比例放大或缩小上述反应体系。
• 放射标记RNA的合成：
  
  • DNA模板经限制性核酸内切酶酶切线性化。
    
  • 酚/氯仿抽提DNA，用乙醇沉淀后，溶于适量的无菌去离子水中。本步骤也可以使用适当的DNA纯化试剂盒，例如百奥莱博的DNA纯化试剂盒(YT009)，直接进行纯化，从而免去了酚氯仿抽提和乙醇沉淀这些步骤。
    
  • 参考如下表格设置反应体系：
    

    成分	用量
    5×Transcription Buffer	4μL
    3 NTP Mixture (10mM each,without CTP)	1μL
    100μM CTP	2.4μL
    [α-32P]-CTP,～30TBq/mmol(800Ci/mmol)	1.85MBq(50μCi)
    线性DNA模板	0.2～1μg
    Ribonuclease Inhibitor	20U
    T3 RNA Polymerase	20U
    经DEPC处理的去离子水	至20μL

    
    
  • 37℃孵育1～2个小时。
    
  • -20℃冷却终止反应。
    
  • 分析和检测RNA的标记效率。
    注意：
    ① 按以上方法合成的RNA活性一般为3～5×10⁸dpm/μg。
    ② 上述标记反应中也可以使用[³²P]、[³⁵S]或[³H]标记的其他NTP。使用其他放射性标记的NTP时，其他的NTP需作相应调整。20μL反应体系各成分推荐使用剂量分别为：
    1.85MBq(50μCi) 5'-[α-³²P]-CTP，~30TBq/mmol(800Ci/mmol)；
    11.1MBq(300μCi) 5'-[α-³⁵S]-UTP，＞37TBq/mmol(＞1000Ci/mmol)；
    0.925MBq(25μCi) 5,6-[³H]-UTP，1.1～2.2TBq/mmol(30-60Ci/mmol)。
    ③ 放射性标记NTP浓度低于12μM时，全长转录本合成效率也会下降。
• 其它用途可以参考上述用途或相关文献资料进行。

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